Исследование энзиматической активности биологических продуктов

04.02.2022 104 0.0 0

Определение энзиматической активности биологических продуктов дает возможность получить ряд весьма ценных сведений относительно направления и интенсивности различных метаболических процессов, происходящих на уровне биологической структуры, из которой происходит исследуемый продукт.

Для анализа энзиматической активности можно использовать либо биологические продукты в их первоначальном состоянии, либо жидкую фазу, в которой диспергированы клеточные элементы (экзоэнзимы) либо вытяжки полученные из клеток, подвергнутых определенной экстрактивной физико-химической обработке (эндоэнзимы) (Бах и Энгельгардт).

Новейшим и наиболее эффективным способом получения внутриклеточных энзим является способ гомогенатов. При этом способе клетку подвергают воздействию ряда литических агентов (гипотонические растворы, ультразвук, лизозим, бактериофаг), после чего посредством дифференцированного центрифугирования разделяют различные освобожденные компоненты. Распад клетки с помощью ультразвука может, однако, одновременно повлечь за собой уничтожение клеточных структур; таким, образом применение лизозима или бактериофага (в случае бактерии) дает возмоясность удерживать протопласты на клеточных остатках и таким образом удалить их из экстракта при центрифугировании. Устранение этих затруднений оказалось возможным в результате использования механических средств растирания бактериальной клетки. Для этой цели используются либо ручные средства (растирание в ступке с помощью кварцевого песка), либо специально сконструированные аппараты (атомизор, Waring blendor и др.).

С помощью современных методов в клеточных гомогенатах удалось выделить 4 большие фракции: (а) ядерная фракция, содержащая ядерные гранули и осаждающаяся первой при центрифугировании гомогената; (б) митохондриальная фракция, состоящая из крупных гранулей протоплазмы; (в) микрозомиальиая фракция, состоящая из малых гранулей цитоплазмьг и (г) растворимая фракция, остающаяся после полного центрифугирования.

Ядерная фракция осаждает при небольших центробежных усилиях (10000 G, в течение 10 минут), в то время как митохондриальная и микрозомиальная фракция – так называемые субмикроскопические фракции – выпадают при приложении больших центробежных усилий (свыше 100000 G). Дифференцирование компонентов субмикроскопических фракций производят в зависимости от скорости их осаждения, пользуясь для этого либо выражением предложенным Александером (1956), либо выражением в единицах Сведберга. В формуле по Александеру, фракция р частиц, выделенная после центрифугирования при 100 000 G в течение 30 минут, определяется знаком 110. р. 30. Согласно выражению, предложенному Сведбергом, компоненты опрделяемые, например, знаком 70 S, представляют собой частицы выпадающие при дифференциальном ультрацентрифугировании при 70 единицах Сведберга (1 единица Сведберга = 1S == 10~13 см в секунду и единицу площади).

Энзимы в ядерной фракции, наряду с общим количеством клеточной дезоксирибонуклеиновой кислоты и довольно значительного количества рибонуклеиновой кислоты, был идентифицирован дисфосфопиридиннуклеотид, — белковая группа синтезирующего энзима дезоксирибонуклеиновой кислоты.

В митохондриальной фракции было выявлено наличие энзимов катализирующих цикл трикарбоксиловых кислот, электронную передачу, окислительное фосфорилирование, окисление липидов и синтез гиппуровой кислоты, цитрулина, ацетилхолина, фосфолипидов и др. В микрозомиальной фракции, содержащей гранули, получающиеся в результате фрагментации эндоплазматического ретикула были обнаружены уриказа, кислая фосфатаза, цитохромредуктаза, фосфокиназа и др. Надосадочная жидкость гомогенатов, являясь растворимой фракцией содержит все энзимы, участвующие в синтезе гликогена и в гликолизе.

В качестве катализаторов белкового происхождения химических реакций, протекающих в живом веществе, энзимы подвергаются влиянию факторов окружающей среды. Температура, pH, концентрация субстрата и энзима, излучения, а также различные ингибирующие или стимулирующие вещества (эффекторы) являются факторами, обуславливающими энзиматическую активность, присутствие которых необходимо учитывать при определении активности этих веществ.

Специфичность воздействия на тот или иной субстрат, свойственная главным образом белковой части энзима (апоэнзима), является наиболее важной характеристикой этих биокатализаторов. В основе большинства классификаций энзимов лежит именно эта специфичность по отношению к катализируемому биохимическому процессу. В этой связи довольно простая и правильная классификация была дана Гоффманом-Остенгофом, которая различает:

1.  Энзимы катализирующие реакции типа
А + Bz^C + D.

В числе их имеются гидролазы, трансферазы и оксидоредуктазы ид» окислительные энзимы.

2. Энзимы катализирующие реакции типа:
А + В^С как например, лиазы и синтетазы.

3. Энзимы катализирующие реакции типа:
А^В
как например, изомеразы и рацемазы.

На V Международном биохимическом Съезде (Москва, 1961) была официально принята классификация энзимов в зависимости от природы катализируемого процесса, причем свыше 700 известных в настоящее время энзимов сгруппированы в этой классификации в 6 Классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы.

Описание методов изучения активности всех энзимов нуждалось бы в пространном изложении, поэтому в настоящей главе будут описаны только гидролизующие энзимы, трансферазы и окислительные энзимы, причем будут освещены способы исследования каталитической активности наиболее представительных энзимов из этих классов.

В некоторых случаях определение энзиматического содержания того или иного препарата можно производить непосредственно, например, если исследуемые энзимы характеризуются строго определенным абсорбционным спектром. Однако, чаще всего непосредственное определение энзимов не представляется возможным. В подобных случаях количество присутствующих в препарате биокатализаторов определяют косвенным путем, и именно дозируя интенсивность специфической активности определенного количества препарата. Скорость превращения субстрата является критерием оценки энзиматической концентрации и одновременно степени чистоты энзима. Эта скорость выражается в условных единицах, относящихся к известному количеству препарата или к значениям белкового N в соответствующем объеме препарата. Все эти оценки предполагают применение элементарных расчетов, простого тройного правила и др., которые не излагаются отдельно в рамках каждого описанного метода, так как это излишне загрузило бы текст. Все же в каждом необходимом случае приводится определение энзиматической единицы в форме, в которой она обычно встречается в специальной литературе.

Гидролазы

Гидролазы катализируют разрыв связей между углеродом и другими атомами (О, S, N), одновременно связывая одну молекулу воды на уровне связи, на которую они воздействуют:

R–R' + НОН ^ R – ОН -f R' - Н

Среди гидролаз наиболее важными группами энзимов являются: эстеразы, карбогидразы, протеолитические энзимы, амидазы и нуклеазы.

Эстеразы

В эту группу входят энзимы, катализирующие распад углеродных, фосфорных или серных сложных эфиров.

Эстеразы карбоновых кислот

Эстеразы карбоновых кислот включают ряд энзимов, как например, (а) собственно эстеразы, вызывающие распад эфиров (например, метил-бутират); (б) липазы, гидролизующие тройные эфиры глицерина; (в) ацетил-эстеразы, расщепляющие эфиры уксусной кислоты; (г) холестеролэстеразы, гидролизующие эфиры, в которых холестерин играет роль спирта; (д) энол-ектеразы, гидролизующие эфиры В-замещенных спиртов (холинэстеразы бензоилхолинэстеразы, атропинэстеразы, кокаинэстеразы, тропакокаин-эстеразы); (е) таназа, гидролизующая танин и метиловый эфир галловой кислоты; (ж) лецитиназы (А и В), гидролизующие лецитины и т. д.

Активность эстеразов можно определять непосредственно на содержащем их продукте (слюна, желудочный сок, кровь, моча, сыворотка, фильтрат бактериальных культур, клеточные взвеси) или на клеточных тритуратах. Для извлечения энзима из клеток можно использовать растворители, как например, толуол и глицерол, одновременно экстрагирующие лишь небольшую часть инородных белков. Опарин и сотрудники применяют метод толуолового автолиза для получения других энзимов, как например, инвертазы и мальтазы. Вилыптеттер и Вальдшмидт предложили более продуктивный метод, применяющий ткани в порошке, предварительно обезвоженные повторной обработкой ацетоном и эфиром. Получаемый порошок подвергают экстракции 87% глицеролом или аммиаком 0,025 н. Глицериновый экстракт стабилен; из этого последнего эстеразу молено очистить посредством асдорбции на гидроокиси алюминия и э люции с фосфатом аммония с 2–5% глицерина. Аммиачный экстракт необходимо нейтрализовать уксусной кислотой, а образовавшийся таким образом осадок снова берут с толуолом или концентрируют под вакуумом.

Определение зстеразной активности можно производить: 1) титриметрически; 2) сталагмометрически; 3) манометрически; 4) колориметрически или 5) нефелометрически. Наиболее часто применяемыми методами являются титриметрические и сталагмометрические.

1. Титриметрический метод позволяет оценить энзиматическую активность посредством определения количества энзиматически освобождаемой кислоты из используемого в качестве субстрата эфира. Для этой цели можно использовать то или иное растительное масло (оливковое, подсолнечное, и др.) или какой-либо другой эфир. Когда субстрат характеризуется слабой растворимостью, для получения тонкой взвеси можно добавить какой либо эмульгатор, как например, груммиарабик, Твин 80 и др.Субстрат эмульгируют посредством механического взбалтывания в течение одного часа в аммиачном буферном растворе (NH3 и NH4C120,1 м) с pH 8,9 к которому в качестве активатора добавляют 0,l CaCla и 0,15°. сывороточного альбумина. Окончательная концентрация субстрата: 20%.

Реакционная система содержит 13 мл субстрата и 2 мл энзиматического препарата, причем оба компонента предварительно нагревают до 30°С. При этой температуре (если не существует каких либо других особых указаний) проводят всю реакцию. По истечении 30, 60 и 120 минутного контакта берут по 5 мл из смеси и титруют кислоту, выделившуюся в результате воздействия энзима. Титрование производят спиртным КОН 0,01 н. или еще лучше посредством электротитрования. Получаемые результаты относят к 1 мл энзиматического препарата.

Эстеразовой единицей является количество энзима, способное гидролизовать в течение одного часа при 30°, 24% из 2,5 г оливкового масла (с числом омыления 185,5), если это количество взвешивают в 13 мл аммиачного буферного раствора с pH 8,9 и если в качестве активаторов присутствуют ионы кальция и альбумина.

Если определения имеют только сравнительное значение, их можно производить серийно, используя субстрат взвешенный в нетампонированной воде, к которой добавлен индикатор pH (например, бромтимол синий). Время необходимое для перехода окраски индикатора позволяет оценить интенсивность энзиматической активности.

2. Сталагмометрический метод пользуется сильным восстановительным действием трибутирина на поверхностное натяжение воды, основываясь также на том, что благодаря энзиматическому гидролизу поверхностное натяжение возвращается к значению дистиллированной воды. Изменения поверхностного натяжения оцениваются сталагмометрически, используя для этой цели специальную пипетку – капельницу (сталагмометр типа Траубе) с определенной емкостью шарика (рис. 58).

Сталагмометр типа Траубе

Рис. 58. Сталагмометр типа Траубе.

В целях определения эстеразовой активности сталагмометрическим способом, к 100 мл буферного фосфатного раствора 0,1 м. с pH 7,5 добавляют 5 капель чистого трибутирина; смесь вводят в герметически закрыва-ющуюся бутылку, которую для образозания насыщенной эмульсии взбалтывают мешалкой непрерывного действия в течение одного часа. С помощью этой эмульсии калибруют применяемый сталагмометр и строят стандартную кривую. Для этого устанавливают число капель стекающих из сталагмометра, когда этот последний наполнен до верхней метки (на уровне горловины) сначала насыщенной эмулсией, а затем разбавленной эмульсией 1:2 (50% насыщения), 1:4 (25% насыщения), 1:8 (12,5% насыщения), 1:16 (6,25%насыщения), 1:32 (3,125% насыщения)и, наконец, фосфатным буферным раствором (0% насыщения). Откладывая на абсциссе насыщение, а на ординате число эквивалентных капель и соединяя полученные точки, получают стандартную кривую. С помощью этой последней можно определить какой именно концентрации трибутирина соответствует определенное число капель, вытекших из сталагмометра при его наполнении реакционной системой.

Реакционная система содержит 8 мл насыщенной эмульсии трибутирина и 2 мл энзиматического препарата. Предварительно оба компонента нагревают до 30° или до специально указанной температуры, причем момент их смешения считается «нулевым» временем, когда и поизводится первое определение числа вытекших капель. Смесь сохраняют при температуре 30° в течение всего времени наблюдения за реакцией. Определение числа капель производят каждые 30 минут.

Для того, чтобы установить эстеразную активность препарата во время t на стандартной кривой необходимо найти концентрацию трибутирина, соответствующую числу капель, установленному во время t. Полученное значение вычитают из 100 и таким образом получают отсавшееся неомыленным процентное количество трибутирина. В данном случае эстеразной единицей является количество энзима, гидролизующее в течение 60 минут 25% сложного эфира, использованного в качестве субстрата (трибутирин).

3. Манометрический метод применяет аппарат Варбурга измеряя количество С02 освобожденное раствором бикарбоната в результате воздействия кислот, происходящих из энзиматического гидролиза сложных эфиров. Иногда этот метод применяют для определения активности ацетилэстеразы и атропинэстераз.

4. Колориметрический метод был разработан лишь в последнее время. Используемым для этого метода субстратом является п-нитрофенилбутират, дающий путем гидролиза масляную кислоту и п-нитрофенол. Этот последний в присутствии кислой среды окрашивает смесь, допуская проведение фотометрирования.
5. Нефелометрический метод позволяет оценить изменения интенсивности мутности той или иной липидной эмульсии, находящейся в контакте с энзиматическим препаратом.

Эстеразы фосфорных ксилот (фосфатазы)

Что такое фосфатазы

В зависимости от субстрата, на которые воздействуют эстеразы, можно разделить на 5 классов:    

  • фосфомоноэстеразы, гидролизующие ортофосфорные моноэфиру.
  • фосфодиэстеразы, гидролизующие ортофосфорные диэфиры;
  • пирофосфатазы, гидролизующие эфиры пирофосфорной кислоты;
  • метафосфатазы, гидролизующие эфиры метафосфорной кислоты;
  • фосфоамидазы, гидролизующие ортофосфорные амиды.

Следует однако отметить, что в тот же класс фосфатаз входят и другие энзимы, воздействующие на фосфорные эфиры: аденилпирофосфатаза (гидролизует аденозинтрифосфат), холинфосфатаза (холинглицерофосфат), полинуклеотидазы или нуклеазы (нуклеиновые кислоты и полинуклеотиды), нуклеотидаза (нуклеотиды), полифосфатазы (сложные эфиры трифосфорной кислоты) и др.

Определение активности этих энзимов основано на количественной оценке неорганического фосфора, освобождаемого этими энзимами в результате их воздействия на специфический субстрат (глицерофосфат – в случае фосфомоноэстераз, пирофосфат в случае пирофосфатаз и др.). В качестве примера описывается метод определения фосфомоноэстераз.

Фосфомоноэстеразы, как и большинство фосфатаз, являются изодинамичными, т. е. воздействуют на один и тот же субстрат, но в разных условиях.

а) Фосфомоноэстераза I характеризуется оптимальным значением pH между 8,8 и 9,2, активируется ионами Mg++ и является активным главным образом по отношению к глицерофосфату. Была описана в растениях, грибах, дрожжах и бактериях.

б) Фосфомоноэстераза II характеризуется оптимальным значением pH между 5,5–6 и не активируется ионами Mg++. Была выявлена главным образом у животных, присутствуя также у высших растений и некоторых бактерий.

в) Фосфомоноэстераза III характеризуется оптимальным значением эстераз между pH 3,8 и 4,2, благодаря чему ее называют также и «кислой» фосфатазой. Ингибируется ионами Mg++ и отличается значительной лабильностью. Была описана в животных и растительных тканиях, а также у микроорганизмов.

г) Фотомоноэстераза IV характеризуется максимальной активностью при pH 5–6,2, активируется ионами Mg++ и обладает особым сродством по отношению к а-глицерофосфату. Присутствует в значительных количествах в гематиях, дрожжах и некоторых бактериях.

Из выше изложенного следует, что для определения фосфомоноэстераз необходимо пользоваться различными условиями среды. В качестве субстрата применяют буферные растворы а–и (3-глицерофосфата натрия, концентрация которых должна быть эквивалентой 1 мг Р на мл. Используемые буферные растворы для растворения субстрата следует выбирать с особенной тщательностью.

Используя вышеприведенные буферные растворы, приготовляют растворы-субстрат как с а-глицерофосфатом, так и с глицерофосфатом, содержащие 1 мг Р на мл.

Каждая реакционная система содержит таким образом:

  • 3 мл раствора-субстрата (a-или (3-глицерофосфат натрия в виде буферного раствора со значениями pH 2, 3, 4... 10 или 11);
  • 1 мл 0,0lM pacтворa MgSO4 (активатор); в случае определения фосфомоноэстеразы III, вместо раствора MgSО4 вводят 1 мл дистиллированной воды;
  • 1 мл энзиматического препарата.

Параллельно приготовляют контрольный образец с энзиматическим препаратом, предварительно инактивированным посредством кипячения.

Каждую реакционную систему размещают в бутылках из нейтрального стекла, которые можно герметически закупорить. Определение Р освобожденного энзиматически производят по истечении известного промежутка времени (1–24 часа) в зависимости от активности препарата. В течение всего этого периода реакционная система поддерживается при 37°. Если определение освобожденного Р производят по истечении промежутка времени более 24 часа, к реакционным системам необходимо добавить 2–3 капли хлороформа, препятствующего заражению, не нарушая однако энзиматическую активность.

Для дозировки, когда энзиматический препарат содержит клетки, для их удаления необходимо сначала прибегнуть к центрифугированию. Известное количество прозрачной надосадочной жидкости (предположим 2,5 затем обрабатывают равным количеством трихлоруксусной кислоты 0,2. Таким образом образовавшийся белковый осадок удаляют центрифугированием или фильтрованием. Затем, из этой жидкости берут определенно количество и определяют освобожденный фосфор колориметрически методом Бриггса, без предварительной минерализации.

Эстеразы серных кислот (сульфатазы)

В зависимости от гидролизуемого специфического субстрата эти эстеразы бывают различными: фенолсульфатазы (гидролизуют сложные эфиры с карбогидратным радикалом, как например, глюкозо-6-серный эфир); хондросульфатазы (гидролизуют хондроитинсерную кислоту) и др.

В основе методов определения активности сульфатаз лежат принципы аналогичные описанным сля эстераз карбоновых кислот.

1. Титриметрический метод, предложенный Нейбергом и Гоффманном, использует в качестве субстрата калиевую соль серного сложного эфира в 1% концентрации. Известное количество субстрата приводят в контакт с точно установленным количеством энзиматического препарата. К смеси, для поддержания нейтральности реакции в ходе опыта, добавляют карбонат кальция (1%0) так как опыт может быть легко изменен в результате отделения бисульфата калия энзиматическим путем.

Стерильность реакционной системы обеспечивают добавлением нескольких капель хлороформа. По истечении определенного промежутка времени, в течение которого систему выдерживают при. 37°, серную кислоту, выделенную энзиматически из органического соединения, титруют NaOH 0,01 н. или, еще лучше, подвергают электротитрованию.

2. Колориметрические методы используют субстраты с дифференцированной химической структурой, освобождающей, в результате специфического действия энзимы, окрашивающие вещества. Таков случай двойного сульфата калия и индоксила, освобождающего в результате гидролиза индоксил – вещество легко окисляемое в индиго (этот последний можно извлечь толуолом в разделительной колонке и титровать колориметрически).

Таким же образом п-нитрофенолсульфат, освобождая п-нитрофенол под действием энзима, дает возможность произвести колориметрическое титрование. В этом случае единицей фенолсульфатазы считают количество энзима, вызывающего в течение 10-часового контакта с 10 мл субстрата 0,005 м. в буферном ацетате 0,05 н с pH 5,8 при 37°, окраску, яркость которой эквивалентна с получаемой посредством 0,001 мг п-нитрофенола.

Десульфгидразы

Несмотря на то, что активность десульфгидраза отличается от активности гидролаз серных кислот (сульфатаз), все же предпочтительно привести их оцисание вместе с этими последними, так как они вместе непосредственно участвуют в обмене серы.

Десульфгидразы катализируют выделение сероводорода из некоторых тиоаминокислот. В настоящее время известны три отдельные десульгидразы: цистеиновая, гемоцистеиновая й экзоцистеиновая. Цистеиновая десульфгидраза катализирует следующий процесс:

1-цистеин -> сероводород + аммиак + пировиноградная кислота.

Реакция происходит ступенчато.

Актвность десульфгидраз можно установить с помощью аппарата Варбурга. В реакционный сосуд вводят:
1 мл 1-цистеина ОД м.
1 мл фосфатного буферного раствора ОД м pH 7,0;
1 мл энзиматического препарата.

В боковое разветвление реакционного сосуда с помощью пипетки вводят 2 мл раствора ацетата кадмия 20%.

Температура реакции: 35°С.

Выделяющийся во время реакции сероводород поглощается ацетатом кадмия образуя сульфат кадмия. К концу реакции образовавшийся раствор сульфата кадмия количественно переводят в колбу Эрленмейера на 50 мл, куда вливают также промывочные воды. Среду подкисляют H2S04 2 н, добавляют 0,5 г йодистого калия и несколько капель крахмала 1 %. Титруют раствором тиосульфата 0,01 н. до изменения исходной сине-фиолетовой окраски.

Одновременно с использованием инактивированного энзима приготовляют контрольный образец.
Если п–число мл тиосульфата израсходованногод ля образца и N–число мл использованного для контрольного образца, то

(N – n) X 18,5

является количеством цистеина (в мг) расщепленного использованным энзиматическим препаратом в течение промежутка времени, соответствующего продолжительности опыта.

Активность десульфгидраз ингибируют реактивы карбониловой группы, как например, гидроцианистая кислота, гидроксиламин, гидразины, семикарбазид и др. Вследствие диализа активность десульфгидразного препарата увеличивается. Добавление к диализату ионов Zn++, Mg++ или Мп++ восстаналивает энзиматическую активность диализованного препарата.

Карбогидразы

Карбогидразы гидролизуют озиды, катализируя разрыв глюкозидной связи и фиксацию одной молекулы воды.

Так же как и в случае других энзимов, классификацию карбогидраз производят в зависимости от природы катализируемого субстрата. Среди карбогидраз отличаются два крупных класса: олигосахаридазы и полисахаридазы. Первый класс, в рамках которого специфичность является менее очевидной, включает:

а) а-глюкозидазы, активные для мальтозы, а– D-глюкозида, a–D- ксилозида, гептозида и др. По-видимому, в этой группе трахалаза является строго специфичной по отношению к трахалозе.

б) (3-г люкозидазы, активные для (3-D–глюкозида целобиоза, генциобиоза, амигдалина и др. В этой группе одним из дифференцированных энзимов является (3-глюкуронидаза.

в) а-галактозидазы, активные для лактозы, (i-D-галактозида, a-L-apaбинозида, D-фруктозида и др.

Среди полисахаридаз имеются: а) амилазы, гидролизующие крахмал и гликоген; б) целлюлаза, активная для целлюлозы; в) китобиаза, активная для китобиоз; г) сульфомуказа, гидролизующая хондроитинсерную кислоту; д) гиалуронидаза, деполимеризирующая гиалунороновую кислоту.

Принципом определения активности карбогидраз является дозировка восстановительных сахаров, отделенных в результате энзиматического эффекта. В основном для дозировки применяют либо химические методы Хагедорна или с антроном, либо физический метод определения вращательной способности раствора. Разумеется, существуют и более точные методы, разработанные для каждого энзима в отдельности. Для наглядности в качестве примеров приводятся методы определения (3-глюкуронидазы, амилазы и гиалуронидазы.

Активность амилазы

Эту активность можно установить классическим методом 1 изменения окраски, вызываемого йодом в присутствии крахмала, по мере развития его энзиматического гидролиза и выделения более значительного количества восстановительных сахаров. Этот простой способ позволяет получить результаты 
сравнительной ценности. Следовательно, основным вопросом является стандартизация условий работы. В качестве показателя энзиматической активности можно использовать либо время необходимое для того или иного энзиматического препарата, чтобы вызвать изменение окраски из темнофиолетовой в бледно-розовую, либо разбавление энзиматического препарата, способного вызвать это обесцвечивание в течение определенного промежутка времени.

сс-Амилаза, обладающая только деполимеризирующим эффектом на крахмал, может быть измерена с помощью вискозиметрического метода. Для этой цели вязкость подходящей смеси, состоящей из раствора крахмала и энзиматического препарата определяют с помощью вискозиметра (рис. 59), Отмечают время необходимое для понижения вязкости наполовину. Было установлено, что в течение промежутка времени, необходимого для того, чтобы понизить наполовину вязкость субстрата вследствие деполимеризирующего эффекта а-амилазы, выделяется только 1% восстановительных глюкозидных связей. Это показывает, что вискозиметрический способ является достаточно чувствительным для определения активности а-амилазы.

Вискозиметр типа Оствальда

Рис. 59. Вискозиметр типа Оствальда

Гиалуронидаза

Это – мукополисахаридаза, обладающая специфическим действием на гиалуронат – глюкозидный полимер с особой ролью в получении консистенции основного вещества соединительной ткани, водянистой влаги, синовальной жидкости и др.

Гиалуроновую кислоту, необходимую для определения активности гиалуронидаз можно получить в самородном виде (более подходящем для этой цели) при помощи весьма несложного метода из пупочных канатиков. Для этого тотчас же после сбора пупочные канатики подвергаются быстрому промыванию для удаления крови, разрезаются на кусочки в 1 см и вводятся в ацетон для обезвоживания. По истечении 3 дней ацетон необходимо переменить, а после этого кусочки пупочного канатика можно сохранять в течение любого промежутка времени. Для извлечения гиалуроновой кислоты эти кусочки вынимают из ацетона, сушат в термостате при 70° и затем вводят в колбу, покрывая их двойным объемом дистиллированной воды. Добавляют несколько мл хлороформа, колбу плотно закупоривают и оставляют на 2–3 дня в термостате, встряхивая колбу время от времени.

Для более быстрого экстрагирования, 15 г, сухих кусочков пупочного канатика можно взять в 100 мл фосфатного буферного раствора с pH 9, добавляя 100 мл раствора трипсина 4%. Смесь оставляют в присутствии хлороформа при 37° в течение 72 часов.

Экстрагируемая жидкость, с вязкой консистенцией центрифугируют для удаления примесей и затем к надосадочной жидкости добавляют 2 объема ацетона и 1 объем этилового спирта. Таким образом, полученная гиалуроновая кислота выпадает в виде длинных нитей, которые можно собрать непосредственно из жидкости на стеклянную палочку. Осадок гиалуроновой кислоты снова растворяют в дистиллированной воде и повторно осаждают ацетоном и этанолом. В заключение его хорошо промывают ацетоном, затем спиртом, и сушат в эксикаторе под вакуумом, на хлористом кальции. Сухая гиалуроновая кислота белого цвета, хрупкая, причем ее можно растереть в ступке и сохранять в виде порошка.
Вязкость раствора 0,2% этого порошка в 5,5–6 раз больше вязкости дистиллированной воды.

Энзиматические препараты гиалуронидазы можно получать из змеиного яда, из культурных фильтратов различных микроорганизмов или посредством водного экстрагирования тканей яичек (жеребца), растертых с кварцем и отфильтрованных (или центрифугированных).

Для определения гиалуронидазовой активности было описано несколько методов.

1. Вискозиметрический метод заключается в определении времени снижения наполовину вязкости раствора гиалуроновой кислоты, находящегося в контакте с энзиматическим препаратом. Для этого пользуются вискозиметром конструкции Оствальда (рис. 59) известной емкости (около 4–5 мл) для определения времени стечения смеси «субстрат + энзим». Определения повторяют (с промежутками времени в пределах от 2 до 20 минут) до тех пор, пока время стечения не сократится наполовину разницы между исходным временем стока системы и временем стока смеси, в которой раствор субстрата заменен дистиллированной водой.

Результаты выражаются в «вискозиметрических единицах», считая единицей количество энзима, которое в течение 20 минут способно сократить наполовину вязкость раствора очищенного гиалуроната 0,1%.

Для проведения сравнительных исследований, результаты можно выразить в виде кривых. Для этого все вискозиметрические значения, определенные в различные промежутки времени, сводятся к произвольному масштабу между 0 и 100, в котором 50 представляет собой определение, соответствующее сокращению вязкости на 50% по отношению к исходному значению субстрата. Скорости, с которыми энзимы расщепляют субстрат при достижении вязкости данного значения, служат опорной точкой для сравнения активности различных исследуемых энзиматических препаратов. Для построения кривых используют известную формулу.

2. Тест осаждения (mucin dot prevention) применяет серийные разбавления препаратов, взятых по 0,5 мл в трубки для агглютирования. Затем добавляют по 1 мл смеси гиалуроновой кислоты 1 % и бычьей инактивированной сыворотки 1%. В качестве контрольного образца пользуются аналогичной смесью, в которой энзим был предварительно инактивирован посредством нагревания. Затем, серию трубок инкубируют в течение 20 минут при 37°С, после чего погружают в воду со льдом и по истечении 5 минут добавляют по 0,2 мл уксусной кислоты 2 н. Трубки встряхивают и затем наблюдают за образованием характерных осадков в виде нитевидных скоплений (mucin clot). Подобный осадок должен появиться в контрольной трубке. Кроме того, осадок образуется в трубках, содержащих значительные разбавления энзима. Трубка с наибольшим разбавлением, уже не допускающим образования осадка, считается индикатором титра активности препарата, причем соответствующее разбавление принимается за титр.
Тест осаждения нельзя проводить с гиалуроновой кислотой большой чистоты, а только с препаратами в их исходном виде.

3. Турбидиметрический метод, предложенный Мейером, разработан на основании вышеописанного теста осаждения. Согласно этому способу в ацетатном буферном растворе 0,1 м. с pH 6,0 делают серийные разбавления энзима. Из каждого разбавления в трубку для агглютинирования вводят 1 мл и все трубки нагревают в течение 5 минут в водяной бане при 37°. Затем добавляют 1 мл субстрата, содержащего 4 мг/мл гиалуроната натрия и NaCl 0,3 м, в буферном ацетатном растворе 0,1 м с pH 6,0. Смеси сохраняют в течение 30 минут в водяной бане при 37°, а затем переводят – для инактивирования – в баню с 60°С, где выдерживают в течение 10 мин. Из каждой смеси затем переводят по 1 мл в пробирки содержащие: 3 мл буферного ацетата 0,5 м с pH 4,2 и 1 мл подкисленной лошадиной сыворотки (лошадиную сыворотку приготовляют разбавлением 1:10 в буферном ацетате 0,5 м с pH 4,2 и подкислением НС1 4 н до pH 3,1 с последующим центрифугированием). Серию пробирок, содержащих эти смеси, подвергают энергичному встряхиванию и затем оставляют на 3 часа при комнатной температуре. Мутность, появившуюся по истечении этого промежутка времени, измеряют спектрофотометрически при длине волны 5800 А.

Гиалуронидазовой единицей считается то количество энзима, которое снижает мутность вызываемую 0,2 мг гиалуроната до значения мутности вызываемой 0,1 мг гиалуроната. Значение отсчитывается на стандартной кривой, построенной с помощью 10 разбавлений гиалуроната (0,01–0,5 мг).

В участке соответствующем концентрациям 0,05–0,15 мг гиалуроната, кривая имеет вид прямой линии.

4. Редуктиметрический метод применяет определение роста восстановительного потенциала раствора субстрата, находящегося в контакте с энзиматическим препаратом. Результаты выражаются в общем восстановительном сахаре, выделенном 1000 мл энзиматического препарата в течение 20 минут при 37°С.
Готовят соответствующие разбавления энзима и смешивают по 1 мл разбавлений – прибавляя по 3,3 мл раствора гиалуроната калия 0,5% и 0,83 мл буферного фосфата 0,1 м с pH 6,8–7,0, содержащего NaCl 0,6 м. До приготовления смесей компоненты нагревают в водяной бане при 37°С. Энзим оставляют для воздействия при 37°С в течение 20 минут, после чего из каждого образца берут по 2 фракции, каждая по 1,5 мл и переводят в осадитель, приступая к определению количеств восстановительных сахаров по методу Хагедорна.

Гиалуронидазовой единицей считают количество энзима, отделяющее в этих условиях 1 мг восстановительных сахаров.

Протеолитические энзимы

Протеолитические энзимы осуществляют разрыв пептидных связей (пептидазы) с фиксацией одной молекулы воды:

–CO-NH- + НОН–СО–ОН + H-NH-

Эти энзимы можно классифицировать либо в зависимости от комплексности гидролизованного субстрата, либо в зависимости от условий необходимых для активирования их действия, либо в зависимости от места действия на уровне пептидной молекулы и т. д.

Так, например, в зависимости от комплексности гидролизованного субстрата различают протеиназы, воздействующие на крупные белковые молекулы, и пептидазы, влияющие на белковые молекулы меньших размеров (полипептиды) как, например, те, которые были предварительно подвергнуты действию протеиназ.

В зависимости от места действия на уровне молекулы субстрата различают: эндопептидазы, воздействующие на центральные пептидные связи полипептида (карбоксипептидаза поджелудочной железы, лейцинаминопептидаза, аминотрипептидаза, дипептидаза глицилглицина, пролидаза и др.); экзопептидазы воздействующие на пептидные связи, смежные с полярными группами полипептида (пепсин, ренин, трипсин, химиотрипсин, папаин и др.).

В зависимости от условий необходимых для их активирования различают три группы протеслитических энзимов:

а) Первая группа включает трипсин, пепсин и химиотрипсин, не нуждающиеся в активаторах небелкового происхождения.

б) Вторая группа включает ряд энзимов из растительных и животных тканей (папаин, фицин, катепсины), которые для активности нуждаются в присутствии ряда восстановительных веществ, как например, аскорбиновая кислота, цистеин или глютатион.

в) Третья группа протеолитических энзимов нуждается в присутствии ряда металлических ионов (например Mn++, Mg++, Zn++, Со++ и т. д.) для того, чтобы приобрести активность. Эффект этих «металлопептидаз» ингибируется присутствием обычных нейтрализаторов металлов. Эта группа содержит почти все энзимы растений и животных, определяемые как экзопептидазы. Многие протеиназы животного и бактериального происхождения также активируются металлическими ионами и включаются в эту группу.

Активность протеолитических энзимов

Эту активность определяют дозировкой аминовых или карбоксиловых групп, выделяемых субстратом в результате контакта с энзиматическим препаратом. Для определения аминовых групп можно прибегнуть к: формол-титриметрическому методу Сёренсена, методу Попе-Стевенса, методу Ван Слайка и др.

Титрование энзиматически выделенных карбоксиловых групп проводят посредством гидратного раствора, разбавленного в спирту. Мы не будем останавливаться на этих методах, так как они были описаны в предшествовавших главах.

Вместе с тем, протеолитическую активность можно также оценить с помощью колориметрического метода, использующего свойство нингидрина реагировать с аминокислотами, давая фиолетовую окраску (свойство широко применяемое в хроматографической технике).

Яркость образовавшейся окраски тем интенсивнее, чем больше число аминных групп выделенных в результате действия энзима. Расчет получаемых результатов производят посредством калибровочной кривой, построенной с помощью обычно применяемых в колориметрии методов.

Другой общепринятый метод оценки активности протеолитических энзимов пользуется количественной оценкой роста аминного N в системе подвергаемой воздействию энзима.

Ренин или химозин

Энзим присутствует в желудке новорожденных травоядных и вызывает свертывание молока. Интенсивность каталитического действия этого энзима можно измерить определением наибольшего разбавления энзиматического препарата, способного коагулировать определенное количество обезжиренного молока, разбавленного 1:10 в течение известного времени и в данных температурных условиях. Вместо молока можно использовать также казеиновый раствор (60 г казеина марки Кальбаум или Мерк растворяют в 70 мл NaOH 0,45 н., а конечный объем доводят до 1 литра дистиллированной водой). К каждым 10 мл субстрата добавляюь по 0,25 мл раствора с 94,5 мг СаС12 на 1 мл.

Пепсин

Активность этого энзима можно весьма точно оценить методом с гемоглобином. Для проведения этого определения смешивают при 20°С 1 мл энзиматического препарата с 5 мл раствора гемоглобина 2% в НС1 0,06 н. После 10-минутного контакта добавляют 10 мл 0,3 н раствора трихлоруксусной кислоты, встряхивают и выпавший осадок удаляют фильтрованием. К 5 мл отфильтрованного дигерата затем добавляют 10 мл NaOH 0,5 н и 3 мл реактива для фенола Фолен – Чокэтлэу. Получаемую окраску определяют колориметрически, сопоставляя со стандартным раствором тирозина.

Стандартный раствор содержит 0,0008 миллиэквивалентов тирозина в каждых 5 мл НС1 0,2 н, к которым добавляют 0,5% формальдегида, во избежание разрушения. К 5 мл этого раствора добавляют 10 мл NaOH 0,5 н и 3 мл реактива для фенола (так же, как и для образца). По истечение 5 минут – время необходимое для появления окраски – производят колориметрирование.

Параллельно с образцом приготовляют также контрольный образец для корректирования добавочной окраски, вызываемой красящими веществами (гемоглобин), присутствующими в реакционной системе, которые не осаждаются трихлоруксусной кислотой. Контрольный образец содержит инактивированный нагреванием энзиматический препарат. Значение контрольного образца вычитают из значения анализируемого.

Для превращения количества определенного в образце тирозинового эквивалента в единицы пепсина, Ансон построил «эквивалентную кривую», осуществляемую посредством обычной колориметрической шкалы.

Трипсин

Активность этого энзима можно определить с помощью того же гемогло- бинового метода предложенного Ансоном, лишь с той разницей, что субстрат приготовляют особым образом, смешивая 8 мл NaOH н/1 с 72 мл воды, 36 мг мочевины и 10 мл раствора гемоглобина 22%. Этот щелочный раствор выдерживают в течение 30–60 минут при 25°С для того, чтобы достигнуть соответствующее разрушение гемоглобина. Затем добавляют 10 мл КН2Р04 м/1 и 4 г мочевины, до достижения конечного значения pH 7,5. Этот раствор субстрата можно сохранять в течение продолжительного времени при + 5°С, добавляя, для предупреждения порчи, мертиолат в концентрации 1 мг на каждые 50 мл раствора.

Виллынтеттер предложил для определения активности трипсина метод, применяющий в качестве субстрата раствор нейтрального казеината (6 г казеина и 7 мл NaOH 0,45 н. на 100 мл дистиллированной воды). К 5 мл раствора казеина добавляют 2 мл буферного раствора 2 м. из аммиака и хлористого аммония с pH 8,6 и 1 мл энзиматического препарата. Инкубация в течение 20 минут при 30°С. Затем дигерат переводят в колбу Эрленмейера на 250 мл, в которую добавляют 5 мл дистиллированной воды и 15 мл абсолютного спирта, использованных для ополаскивания исходного сосуда. Для титрования добавляют также 2 мл раствора тимолфталеина 0,5% и спирта. Титрование производят до бледно-голубого цвета, применяя NaOH
0, 2 н. в спирте 90%. После этого добавляют 120 мл кипящего абсолютного спирта и затем титрование продолжают до получения бледно-зеленой окраски.

Из полученных таким образом значений необходимо вычесть значение контрольного образца, обрабатываемого аналогичным образом, в составе которого находится энзиматический препарат, предварительно инактивированный нагреванием.

Трипсиновой единицей считается то количество энзимов, которое при вышеуказанных условиях вызывает гидролиз количества казеината, нейтрализации которого необходимо 1,05 мл спиртного раствора гидрата.

Амидазы

Амидазы катализируют гидролиз связей С–N:

= N–С– + НОН ^ = N-H + НО-С-

В зависимости от типа катализируемого субстрата различаем:

  • ациламидазы: аспарагиназа, глутаминаза, уреаза;
  • циклоамидазы: алантоиназа, гистидиназа, уроканиназа;
  • амидиназы: аргиназа, креатинамидиназа.

В группу амидазов можно также включить, благодаря типу гидролизованных связей, как аминазы (аденозинмонофосфатаминаза, гуанозин-аминаза), так и нуклеозидазы. Учитывая дифференцирующую роль нуклеозидазов, лучше всего описать их вместе с нуклеазами.

В качестве типа амидазовой активности приводится описание определения активности уреазы, аргиназы и амидазов типа аспарагиназы.

Уреаза

Уреаза – первый энзим, выделенный в кристаллическом виде (Сумнер, 1926) и в то же время первый энзим, в котором было установлено присутствие группы – SH (Сумнер и Поланд, 1933). Уреаза известна уже давно, будучи отмечена Пастером (1860), как причина аммиачного брожения мочевины. Энзим катализирует разложение мочевины в углекислоту и аммиак – свойство лежащее в основе методов определения уреазовой активности.

Таким образом, выделяемую углекислоту можно определить манометрически с помощью аппарата Варбурга.

Аммиак можно определять титриметрически. В этом случае в качестве субстрата применяют раствор мочевины 5% в буферном фосфате 0,1 м. с pH 7,0, к которому добавляют 2% нейтролизованного гуммиарабика или белков, гидрофильные коллоиды, цианистую или сероводородную кислоту, аминокислоты или другие вещества, отличающиеся высоким сродством по отношению к металлическим ионам (Fe, Hg, Си, Cd, Pb). Эти последние быстро инактивируют уреазу и так как их присутствие – в виде незначительных следов – часто наблюдается в дистиллированной воде или других растворах, применяемых в реакционной системе, то необходимо пользоваться нейтрализующими агентами в виде вышеописанных.
50 мл раствора субстрата смешивают с 1 мл энзиматического препарата и инкубируют в течение 5 минут при 20°С. Затем, реакцию приостанавливают, а энзиматически выделяемый аммиак переводят в известное количество кислоты путем барботирования реакционной системы воздухом (предварительно пропущенным через соляную кислоту). После добавления 15 мл каприлового спирта и 0,5 г твердого карбоната калия, титруют количество кислоты, оставшейся нейтрализованной, увлекаемой аммиаком. Количество нейтрализующего аммиака получают в виде разницы.

Энзиматической единицей считается количество энзима, выделяющее в вышеуказанных условиях 1 мг аммиачного N в течение 5 минут при 20°С. Кристаллическая уреаза содержит около 133 000 энзиматических единиц на 1 г.

Фториды, галогены, бораты, киноны, формальдегиды и перекиси ингибируют уреазную активность.
Аспарагиназа, глютаминаза, аспартаза, триптофаназа, гистидиназа и остальные энзимы, вызывающие выделение аммиака, можно титровать так же как и уреазу, применяя дозировку аммиака.

Аргиназа

Аргиназа расщепляет аргинин в орнитин и мочевину. В отличие от уреазы, аргиназа активируется Со, Mn, N1, ионом железа в присутствии цистеина или аскорбиновой кислоты, металлическими комплексами сульфгидриловых соединений и др. Поскольку в результате диализа эти ионы удаляются, одновременно с этим процессом происходит инактивирование энзима. Диаминокислоты (орнитин, лизин) ингибируют активность энзима. Ионы железа и ртути, а также бораты и цитраты оказывают также ингибирующее действие.

Аргиназную активность определяют косвенным путем, а именно оценкой количества выделенной мочевины. Раствор аргинины, тампонированный до pH 9,5 приводят в соприкосновение с аргиназовым препаратом на 20 минут. По истечении этого промежутка времени pH реакционной системы понижается до 5,0 после чего добавляют известное количество уреазы, активность которой (энзиматические единицы на 1 мл) известна. В результате воздействия этого энзима можно оценить количество мочевины выделяемой энзиматически аргиназой и вместе с тем количество гидролизованного аргинина.

Нуклеазы

Предпринятые в последние годы многочисленные и обширные исследования в области структуры и метаболизма нуклеиновых кислот способствовали более подробному ознакомлению с энзиматическими процессами синтеза и распада этих веществ.

Шмидт классифицирует нуклеазы в зависимости от специфичности их действия, различая:

  • энзимы катализирующие разрыв связей между нуклеотидами (рибо-нуклеазы, дезоксирибонуклеазы, «неспецифические» фосфодиэстеразы);
  • энзимы, катализирующие гидролитический разрыв связей фосфорильных групп в молекуле мононуклеотидов (нуклеотидазы или нуклеотидные фосфотазы);
  • нуклеозидкиназы;
  • энзимы, воздействующие на аминовые группы пуриновых и пиримидиновых соединений (дезаминазы и пуриновые и пиридиновые транс-аминазы);
  • энзимы, ведущие к разрыву связей между щелочными группами нуклеозидов и углеводов (фосфорилазы и нуклеозидные гидролазы);
  • ксантиноксидаза;
  • энзимы, катализирующие завершение пуриновых и пиримидиновых циклов.

Поскольку описание всех этих энзимов невозможно в рамках настоящей работы, ниже будут описаны лишь основные нуклеазы: рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы и нуклеотидазы.

Рибонуклеазы

Рибонуклеазы были описаны в самых разнообразных видах клеток (у животных, растений и бактерий). Наиболее подробно изученной рибо- нуклеазой является панкреатическая (рибонуклеаза I), отмеченная в 1920 году Вальтером Джонсом и полученная в кристаллическом виде Кунидем.

Рибонуклеаза ведет к разрыву межнуклеотидных связей рибонуклеотидного полимера, одновременно обеспечивая внутримолекулярное транс-фосфорилирование с последующим гидролизом (действие аналогичное эффекту фосфомоноэстеразов). Рибонуклеаза не гидролизует любую связь между нуклеотидными компонентами нуклеиновой кислоты, а катализирует только разрыв связей между трипиримидиннуклеозидными и смежными 5-гидроксильными группами пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.

Активный рибонуклеазовый препарат можно получить из поджелудочной железы. Эту последнюю тотчас же после убоя очищают от жира и соединительной ткани, затем разрезают на кусочки по 20–40 г и переводят в сосуд с H2S04 0,25 н. Сосуд сохраняют в посуде с водой в течение транспорта от скотобойни до лаборатории. Здесь поджелудочную железу пропускают через мясорубку и к каждому объему рубленного материала добавляют 1–2 объема H2S04 0,25 н. Смесь оставляют на ночь на холоде (ниже + 5) и на следующий день пропускают через полотно. Оставшийся на полотне осадок снова подвергается экстрагированию с H2S04 0,25 н. и фильтрованию.

Обе отфильтрованные жидкости соединяют и насыщают сульфатом аммония, добавляя 114 г (NH4)2S04 на каждые 1000 мл фильтрата (насыщения 0,2). Образовавшийся осадок удаляют фильтрованием через фильтровальную бумагу.Прозрачный фильтрат желтого цвета доводят до насыщения 0,4, добавляя еще 121 г (NH4)2S04 на каждые 1000 мл фильтрата. Оставляют на 1–2 дня при + 4°С для полного осаждения.
Образовавшийся осадок можно использовать для приготовления дезоксирибонуклеаза.

Надосадочную жидкость собирают сифонированием и на каждые 1000 мл добавляют по 183 г (NHJ 2S04 (насыщение 0,65). Оставляют на час в покое, затем образовавшийся тонкий осадок удаляют центрифугированием.

Надосадочную жидкость фильтруют через бумагу Шарден и доводят до насыщенности 0,8, добавляя еще 102 г кристаллического сульфата аммония на каждые 1000 мл жидкости.

Образуется белый осадок,- который собирают центрифугированием, промывают насыщенным раствором сульфата аммония и высушивают в эксикаторе на пятиокиси фосфора.

После сушки растворяют в 20–50 мл дистиллированной воды и подвергают диализу (48 часов в противотоке водопроводной водой и 24 часа на холоде, в противотоке дистиллированной водой).

Таким образом полученный диализ характеризуется высокой рибо- нуклеазовой активностью (в присутствии ионов Mg++).

Методы определения рибонуклеазовой активности применяют: 1) либо оценку кислоторастворимых продуктов, получаемых при распаде рибонуклеиновой кислоты (РНК), 2) либо титрование фосфорильных групп, выделенных в результате воздействия энзима, 3) либо манометрическое определение повышения свободной кислотности, 4) либо определение снижения интенсивности абсорбции в ультрафиолетовом спектре по мере интенсификации энзиматического гидролиза РНК.

1. Определение кислоторастворимого Р, выделяемого в результате энзиматического гидролиза, является наиболее часто применяемым способом разработанным Куницом. В качестве субстрата используют полимеризованную рибонуклеиновую кислоту (препарат Мерка).

Для приготовления субстрата в 100 мл ацетатного буферного раствора 0, 1 м. с pH 5, растворяют такое количество нуклеиновой кислоты, чтобы в конечном итоге получить 0,5 мг общего фосфора на 1 мл.

Соответствующее количество энзиматического препарата (1 мл) и субстрата (5 мл) смешивают в центрифужной пробирке и инкубируют при 25° в течение 10 минут. Затем для приостановления энзиматической реакции и осаждения кислотонерастворимых соединений добавляют равный объем (5 мл) осаждающего вещества: ацетат уранила 0,25% в трихлоруксусной кислоте 2,5%. Встряхивают и оставляют на 30 минут при 25°С, затем центрифугируют на протяжении 20 минут при 6 000 об/мин. (или фильтруют), а в надосадочной жидкости (фильтрате) фосфор определяют по методу Бриггса.

Для каждого образца используют два контрольных образца. В одном энзиматический препарат предварительно инактивируют нагреванием, а в другом – энзиматический препарат заменяют дистиллированной водой. При подсчете разницы между количеством фосфора, обнаруженным в образце и установленным в контрольных, образцах получают фактическое значение энзиматической активности исследуемого препарата.

Рибонуклеазной единицей Куница считают количество энзима, выделяющее в описанных условиях 0,1 мг (1 лг) кислоторастворимого фосфора на каждый мл субстрата.

2. Титриметрический метод был также разработан Куницом и усовершенствован Алленем и Эйлером. Титрование производят электрометрически, в отношении фосфорильных групп, выделяемых при значении pH, которое не должно превышать пределы 5,9–6,2, так как при этом значении pH значения константы диссоциации рК, одновременно отделяемых аминогрупп, являются незначительными.

Подсчет результатов производят с помощью титровальных кривых, которые можно построить пользуясь видоизмененным уравнением Гендерсона-Гассельбаха.

3. Манометрический метод также позволяет определить фосфорильные группы отделенные в течение энзиматического гидролиза. Их выявление возможно посредством оценки количества С02, выделяемого бикарбонатным раствором (присутствующим в реакционной системе) в результате увеличения количества кислотных групп, выделенных энзимом из рибонуклеиновой кислоты, использованной в качестве субстрата.

4. Спектрофотометрический способ позволяет определить количество рибонуклеиновой кислоты расщепленной в присутстии рибонуклеазы, путем измерения снижения интенсивности абсорбции образца в ультрафиолетовом спектре. Используют источник ультрафиолетовых лучей с длиной волны 2900 А (при 2600 А происходит абсорбция вызываемая пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, не изменяющаяся в результате контакта с энзиматическим препаратом).

Рибонуклеазная активность активируется в присутствии ионов Mg++. Оптимальный эффект энзима достигается при pH 7,7, причем, однако, активность наблюдается и при меньших значениях pH, а именно от 5 до 6.

При значении pH 5 установлено, что оптимальной температурой является 65°, а при значении pH от 2 до 5 энзим, подвергаемый действию температуры в 100° в течение 10 минут, инактивируется лишь 20%.
Гепарин оказывает ингибирующее действие на рибонуклеазу. Фтористый натрий (ОД м) не оказывает какого-либо воздействия на рибонуклеазу. Ионы меди и п-хлорортутнобензоат (сульфгидрильный реактив) вызывает инактивирование энзима.

Дезоксирибонуклеаза

Ее можно приготовить из поджелудочной железы, исходя из осадка получаемого в результате насыщения кислой панкреатической вытяжки сульфатом аммония до 0,4.

Этот осадок фильтруют через фильтровальную бумагу (Шлейхер – Шулль), затем снова растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды (10 г осадка можно взять с 50 мл дистиллированной воды). К каждому 100 мл раствора добавляют 20 мл насыщенного раствора сульфата аммония (насыщенность 0,17), а выпавший осадок удаляют фильтрованием.

Фильтрат доводят до насыщенности 0,3 используя 7,91 г (NH4) 2S04 на каждые 100 мл фильтрата. Образовавшийся осадок собирают фильтрованием и затем снова растворяют в воде (10 г влажного осадка на 50 мл дистиллированной воды).

Раствор подкисляют до значения pH 4,0–4,5 и затем к каждым 100 мл жидкости добавляют 20 мл насыщенного раствора сульфата аммония; фильтруют и фильтрат снова доводят до насыщенности 0,3 посредством сульфата аммония (7,91 на каждые 100 мл), а выпавший энзиматический осадок растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды (10–20 мл).

Этот конечный раствор диализуют в течение двух дней при + 4°С с противотоком H2S04 0,002 н. Затем диализат замораживают (–10°С) и подвергают высушиванию под вакуумом.

С помощью этого метода из каждых пяти кг поджелудочной железы можно получить 1–2 г сухого энзима.
Дезоксирибонуклеаза была отмечена еще в 1903 году Араки, который установил, что экстракты тимуса, селезенки и печени оказывают разжижающее действие на гели дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Этот деполимеризирующий эффект дезоксирибонуклеазы на ДНК, сопровождаемый выраженным снижением вязкости растворов ДНК, лежит в основе наиболее часто применяемого способа определения активности дезоксирибонуклеазы.

Вискозиметрический метод применяет вискозиметр капиллярной трубкой (типа Оствальда, рис. 59), в котором в зависимости от его емкости вводят соответствующее количество смеси энзиматического препарата и субстрата. Раствор субстрата содержит 0,5% ДНК, полимеризованного в боратном буферном растворе 0,1 м. с pH 7, к которому добавляют сульфат магния 0,025 м.

Время истечения смеси в вискозиметре хронометрируют тотчас же после осуществления смеси (нулевое время) и затем каждые пять минут в течение получаса. Одновременно с соответствующими образцами приготовляв также и контрольный образец, в котором энзиматический препарат бьщ предварительно инактивирован при 60°С; контрольный образец не должен отличаться деполимеризирующей активностью.

Определение производится при 37°С.

Принимая во внимание, что каталитическая активность является моно- молекулярной, расчет рибонуклеазной активности производят с помощью известного уравнения.

Вискозиметрической единицей дезоксирибонуклеазы считается эквивалент количества энзима, имеющий в описанных условиях после 30-минутного действия значение «К »=1 х 10 8.

Дезоксирнбонуклеазовую активность того или иного препарата можно определить, так же как и в случае рибонуклеазы, методами определения выделенного кислоторастворимого Р, фосфорильных групп или посредством определения интенсивности поглощения ультрафиолетовых излучений с длиной волны 6400 А.

Дезоксирибонуклеаза активируется в присутствии двухвалентных катионов (Mg++, Mn++, Fe++, Со++).

Цитрат и фторид, нейтрализующие катионы, являются ингибиторами энзиматической активности. Вместе с тем медь, селенит и арсениат ингибируют действие дезоксирибонуклеазы уже в концентрациях 0,001 м. Гидроксиламин, цистеин и йодуксусная кислота не оказывают значительного эффекта. Митотические яды, как например, аминоптерин, кольхитин, сульфгидрильные реактивы (йодацетамид и п-хлор-ацетофенон) вызывают понижение дезоксирибонуклеазовой активности.


Читайте также:

Комментарии
Имя *:
Email *:
Код *: